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    更新时间:2022-12-01

    简要描述:

    fish技术服务(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。

      fish技术服务(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性,荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来,通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交,在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数,从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断,为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末,Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后,FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用,显示出与一些传统技术相比的明显优势。

     

      荧光原位杂交技术fish技术服务与传统的免疫组织化学法(IHC)相比,FISH具有良好的稳定性和可重复性。目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大(例如酸、碱和变性剂),检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外,免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断,对于一些弱阳性的结果,不同的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的终诊断。

     

      荧光原位杂交技术fish技术服务的对象是细胞中的DNA,致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良好,其结构稳定,不易被环境条件影响,为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此外,荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数,客观地量化了检测地结果。如果借助于相应的FISH操作系统(例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000样本预处理系统)和染色体成像系统就能实现整个FISH操作的自动化,大限度的降低操作者和检测者的主观因素,确保结果的准确性。

     

      PCR由于灵敏度高,操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术,但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高,对同一样本也只能作一次分析,不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展,FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水平,并能很好弥补PCR技术的局限。荧光原位杂交技术fish检测不仅有极低的假阳性、假阴性的比例(以Abbott-Vysis的产前诊断探针为例,29,000例的使用结果证实正确率高达99.9%),还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常,大大节省了检测的时间。此外,通过fish技术服务可以对染色体或特定基因的数目异常,特定片断的缺失、易位和重排进行诊断研究。

     

      荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点,目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。

     

    fish技术服务基本原理

      简单点说就是碱基互补配对原则,就是我们将外源核酸(也就是常说的分子探针)与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对,形成核酸杂交分子,再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。

     

      探针分类
      ●DNA探针:双链重组DNA(cDNA)探针是目前应用较多的探针类型。特点敏感性高,同样操作难道及费用较高。
      ●RNA探针:今年来RNA探针应用越来越多,这是由于单链RNA探针分子小,在组织内通透性好,用前无需变性,杂交中也不存在退火的情况,可以全部与靶核酸配对杂交
      ●寡核苷酸探针:这类探针多采用DNA合成仪,在不溶性硅石支持物上合成单链DNA寡核苷酸。
      核酸杂交的稳定性依次为:

      RNA—RNA>DNA—RNA>DNA—DNA

     

    应用

      fish技术服务已经在细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用。

     

      一、染色体结构变异与非整倍体的检测

      荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。如植物染色体的非整倍体是由于染色体行为异常,即可能是双亲配子染色体数目和结构差异引起或染色体亲缘关系较远等因素导致。利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体。

     

      二、基因扩增和缺失的检测

      FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能。被扩增基因主要在同一染色体臂上,但离初始亲本基因有一定距离,且经常独立地位于染色体端粒部位;FISH分析表明细胞断裂可能是由于染色体含有扩增区域的结构重排。同时用FISH 可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数,此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦等作物中已获成功。利用FISH技术也可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失,如成功检测了aniridia疾病患者的缺失基因。

     

      三、基因定位

      荧光原位杂交的基因定位技术有着广泛的应用。PP2Ac突变型肺癌相关基因在染色体区域的定位,荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征。结果在正常人淋巴细胞的染色体5q23-31可见明显杂交信号,在GLC-82细胞的5号和7号染色体上出现较强信号。说明点突变引起PP2Ac活性改变,从而基因易位,导致肺肿瘤的产生。FISH技术与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点,表明DNA序列与带型有关。用FISH技术对人类基因组中编码基因分布的研究揭示,基因主要集中在染色体上G+C(占全基因组35% )的DNA区段。FISH技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。应用FISH技术可直接观察染色体端粒,这简化了染色体在核内的结构和功能研究。

     

      四、基因作图
      用fish技术服务可直接检测DNA在染色体上的位置,所确定位置是基因在染色体上实际的物理位置。由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响,FISH技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手段。多色探针标记为探针定位提供了一种更简便的方法。如检测时2个探针用红色,第3探针用绿色,则绿色位点的位置要么在2红色位点之外,要么在它们之间,于是可确定探针顺序。因此,探针被至少20kbp的序列隔开就可以用FISH技术将之定位。

     

     

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